近日，北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、北大成都前沿交叉生物技术研究院王初课题组在Journal of the American Chemical Society杂志上发表了题为“Site-specific Profiling of RNA-binding Proteins Enabled by Isotopic Signature Enhanced Mass Spectrometry”的文章。在这项工作中，作者基于课题组此前发展的特殊同位素信号质谱靶向方法isoSTAR（isotopic signature targeted profiling），开发了名为isoRIC（isotopic signature targeted RNA interactome capture）的位点特异性的RNA结合蛋白组学鉴定新方法，并利用此方法发现了调节RNA-蛋白相互作用的关键氨基酸位点。

　　RNA结合蛋白（RBP）在RNA的剪接、定位、降解等转录后调控中扮演着核心角色，其功能异常与许多疾病的发生发展密切相关。然而，如何精准、全面地捕捉动态变化的RNA-蛋白相互作用，尤其以单氨基酸分辨率精确绘制RNA-蛋白互作的相互作用界面，一直是领域内面临的巨大挑战。目前，在组学水平上鉴定RNA蛋白结合位点的方法通常依赖于紫外交联并结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。在质谱数据依赖性采集（Data-Dependent Acquisition, DDA）模式下，部分RNA交联肽段离子丰度低、负电荷基团多，因此很难被检测到。此外，交联产物的修饰形式的异质性和假阳性问题，也为RNA交联肽段的精确鉴定带来了巨大困难。

　　面对上述挑战，作者将课题组此前开发的实时同位素信号靶向分析技术（isoSTAR）（J. Am. Chem. Soc. 2025, 147, 9, 7513–7523）与同位素编码的非天然核苷代谢标记相结合，开发了同位素靶向的RNA互作位点鉴定（isoRIC）的新方法。首先，作者设计并合成了在尿嘧啶2-O位进行部分¹⁸O取代（¹⁶O: ¹⁸O = 1:2）的光活性核苷4-硫代尿苷（4-SU）。这种同位素4-SU能够被细胞代谢并掺入新合成的RNA中。当用紫外光诱导RNA与蛋白质交联后，所有与RNA交联的肽段都会携带上一个独特的“分子身份证”——一个分子量+2 Da的稳定同位素质量偏移特征。其后，利用同位素编码靶向的isoSTAR技术即可实时监控质谱一级谱（MS1），一旦检测到带有上述特定同位素特征的离子，系统会立即触发二级质谱（MS/MS）扫描，实现对目标交联肽段的“精准打击”。这种策略彻底摆脱了对离子强度的依赖，使得即使含量极低的交联肽段也会被精准靶向鉴定。

　　通过严格的实验验证，isoRIC展现出了相较于传统DDA方法更高的检测灵敏度，三次重复鉴定到的RNA结合蛋白（RBP）和RNA-交联肽段数量均显著多于DDA，其次isoRIC方法具有更高的鉴定准确性，允许研究者基于MS1和MS2水平上稳定的同位素特征有效排除非特异性吸附肽段的干扰。最后，isoRIC方法还鉴定到了一系列非经典RBP，拓展了RNA结合蛋白质组的疆域。

　　凭借其高分辨率，isoRIC不仅可以帮助研究者发现新的RBP，更深入揭示了其RNA相互作用界面上的“热点”残基。在与神经退行性疾病相关的TDP-43蛋白中，isoRIC精准定位了RNA交联位点K263，深入阐释了其病理性突变（K263E）与额颞叶痴呆等疾病的关联性。isoRIC的另一大应用是可以从位点水平层面研究RNA结合蛋白上的翻译后修饰（Post-translation modification, PTM）对其RNA结合能力的直接影响，并深入研究了代谢重编程引起的翻译后修饰如何动态调节RBP的RNA结合能力。

　　该文通讯作者为北京大学化学与分子工程学院、北大-清华生命科学联合中心、北大成都前沿交叉生物技术研究院的王初教授，共同第一作者为王初课题组化学学院博士研究生刘亦成（化学国家高层次人才培养中心入选者）及博士毕业生贾国赓。王初课题组的博士研究生冯天宇、李成蹊及北大成都前沿交叉生物技术研究院的肖伟弟博士也为此课题的完成做出了重要贡献。该工作得到了科技部重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国研中心等项目的支持。

　　论文链接：https://doi.org/10.1021/jacs.5c11224

　　排版：高杨

　　审核：李玲，刘志博