膜电位是反映神经元、心肌细胞和胰岛细胞等可兴奋细胞电生理状态的重要指标，其动态变化记录了细胞活动的复杂过程。荧光膜电位探针能够以单细胞分辨率和高通量检测能力，实现细胞电信号的可视化分析。然而，目前大多数膜电位探针均表现为“负向响应”——即探针荧光在细胞去极化时减弱，而在静息状态下较为明亮。这种特性在组织成像中会导致更严重的背景干扰和光漂白问题。因此，亟需开发在静息态下更暗、去极化时变亮的“正向响应”膜电位探针，以降低背景信号并提升成像质量。

　　2025年8月8日，北京大学化学与分子工程学院邹鹏课题组、未来技术学院陈知行课题组及定量生物学中心汤超课题组合作，在 Science Advances 在线发表了题为 Positive-going hybrid indicators for voltage imaging in excitable cells and tissues 的最新研究成果。他们通过膜蛋白工程改造与生物正交化学标记，成功逆转了负向探针对膜电位的响应极性，开发出正向响应的复合型探针HVI⁺（图1）。其中，HVI⁺搭配高亮度橙色荧光染料Cy3b，对100 mV膜电位变化展现出55% ΔF/F₀ 的灵敏度，成为迄今最灵敏的正向橙色膜电位探针，能够精准刻画神经元和心肌细胞的动作电位波形。此外，HVI⁺还可与负向探针HVI联合使用，实现胰岛中不同细胞类型电活动的同步成像。

　　邹鹏课题组长期致力于细胞生命活动化学探针的研发，在国际上率先提出“复合型膜电位探针”概念，即通过生物正交化学标记，将化学荧光染料与视紫红质蛋白偶联，构建基于电致变色原理的膜电位探针（Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 57, 3949-3953; Nat. Chem. 13, 472-479）。早在2019年，课题组便提出通过视紫红质蛋白工程化改造实现正向响应的设计理念并付诸实践（ACS Chem. Neurosci. 10, 4768-4775）。陈知行课题组则专注于基于化学原理设计新型荧光分子，解决亮度不足、光毒性高和光稳定性差等成像难题。汤超课题组在胰岛细胞振荡机理与调控研究方面具有深厚积累，并建立了稳定可控的成像平台、图像分析算法和数学模型，用于解析胰岛复杂的生理活动。

　　在本项工作中，三方团队通力合作，首先针对视紫红质Ace2的质子供体位点Asp92和质子释放位点Glu199进行突变筛选，调控视黄醛席夫碱的质子平衡，从而逆转探针对膜电位的响应极性。随后，通过连接酶介导的化学标记与逆电子需求狄尔斯-阿尔德反应，将高量子产率的橙色染料Cy3b精确引入工程化改造的视紫红质蛋白特定位点（图1）。最终，研究团队利用该探针观测了不同葡萄糖浓度对胰岛α与β细胞群电活动的调控作用，展示了其在生理研究中的潜力。

　　图1 正向响应的复合型膜电位探针HVI⁺

　　在膜电位成像中，细胞形变常导致信号畸变，尤其在跳动的心肌细胞中更为明显。为解决这一问题，作者设计了比率成像策略：在表达HVI⁺的心肌细胞中，同时标记对膜电位敏感的COT-Cy3和不敏感的COT-Cy5染料，后者作为形变校正参比，保证了染料在膜上的定位与比例一致，并降低了光漂白和细胞毒性。双通道成像结果显示，经过Cy5校正后，不同区域的比率信号高度一致，清晰揭示了心肌细胞形变略滞后于动作电位，验证了比率成像在动态心肌成像中的可靠性与必要性。

　　正向膜电位探针不仅具备更好的光稳定性和更低的背景干扰，还可与负向膜电位探针联用。即使二者共享同一成像通道，其电信号也可凭借响应极性区分，从而在单一荧光通道中同时记录不同细胞类型的膜电位变化。基于这一特性，作者进一步考察了葡萄糖浓度对胰岛α和β细胞电活动的调控。通过腺病毒介导，HVI和HVI⁺探针分别在胰岛α和β细胞中表达，并在3 mM和13 mM葡萄糖条件下同步成像，比较动作电位的频率变化。结果显示，在完整胰岛的旁分泌环境中，葡萄糖从3 mM升至13 mM可逆地显著激活β细胞，而α细胞的电活动则呈现明显的异质性，既有抑制也有兴奋的双重反应。这一现象与α细胞胰高血糖素分泌的U型葡萄糖浓度响应曲线相一致。

　　综上，该研究开发了新一代具有正向响应的复合型探针HVI⁺，并成功应用于可兴奋性细胞和组织的膜电位成像。尽管近年来的研究对胰岛等组织的电生理异质性及细胞间相互作用提出了新的观点和挑战，但相关机制仍未完全厘清。我们期待HVI⁺探针能在神经系统与胰岛电活动研究中推动更深入的探索，带来新的科学发现。

　　北京大学化学与分子工程学院的刘书彰博士，北京大学前沿交叉学院的凌靖博士（现UC San Diego博士后），北京大学前沿交叉学院博后（现未来技术学院助理研究员）谢北辰博士为该论文的共同第一作者。北京大学邹鹏研究员、陈知行研究员和汤超教授为该论文的共同通讯作者。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部、北京分子科学国家研究中心和北大-清华生命科学联合中心的资助。

　　原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ads1807

　　排版：高杨 审核：牛林，刘志博