以对蛋白质进行环化、索烃化、打结等拓扑改造为代表的蛋白质拓扑工程是一种重要的调控蛋白质性质的手段。近年来，基于可基因编码的蛋白质缠结基元和反应基元的“组装-反应协同”理念，发展了包括被动模板、主动模板、原位串联反应等多种拓扑蛋白合成方法。由于环化和机械互锁带来的构象限制效应，索烃化蛋白质具有抗热变性、抗化学变性、抗酶解、抗聚集等稳定化特征，具有重要的实用意义。但是目前构建的大部分蛋白质索烃其缠结结构是由额外的缠结基元介导的，产物中往往存在冗余的序列，其性能也易受额外基元影响，不便于研究和阐明构效关系。因此，单结构域蛋白质索烃的构建至关重要，有助于系统性地探究拓扑对于构效关系的影响，并拓展蛋白质索烃的实际应用。

近期，北京大学张文彬课题组在单结构域蛋白质索烃的设计和合成方面取得重要进展。基于对绿色荧光蛋白（GFP）折叠结构的分析和理解，他们将组成β-桶状结构的11个β折叠片的连接关系进行重新设计，人为引入缠结关系，设计了单结构域绿色荧光蛋白索烃（图1），并实现了细胞内和细胞外的可控合成（图2），发现其相比于野生型具有更好的热回复性（图3）。

图1. 单结构域绿色荧光蛋白索烃的设计。a, 野生型绿色荧光蛋白（PDB：2B3P）的卡通图、拓扑图以及基因卡带。b, 单结构域绿色荧光蛋白索烃的卡通图、拓扑图以及基因卡带。新引入的连接链用深红色和深绿色的加粗线条表示，组成索烃的两个环分别由红色和绿色表示。

首先，利用“组装-反应”协同，作者发展了胞内组装、胞外环化的两步合成法，通过绿色荧光蛋白准轮烷中间体实现了绿色荧光蛋白索烃的合成。值得注意的是，胞外环化反应的过程中，准轮烷中间体可以通过分子内反应形成二索烃或分子间反应形成三索烃，二者可以通过体积排阻色谱高效分离（图2a）。这种设计和构建单结构域索烃的方法还可以拓展到具有类似折叠结构的其他荧光蛋白中。作者将类似的单结构域索烃构建方法进一步应用在来自香菇珊瑚的红色荧光蛋白（mCherry），来自羽珊瑚的绿色荧光蛋白（mWasabi）和来自于维多利亚水母的黄色荧光蛋白（YPet）中，证实了该方法对于荧光蛋白家族具有一定的普适性，成功构建了单结构域荧光蛋白索烃家族。这种单结构域绿色荧光蛋白索烃的环区还容许通过基因工程的手段模块化地融合多种目标蛋白质，从而实现融合蛋白索烃的构建（图2b）。作者还进一步证实，通过应用不同的正交分离型内含肽反应对，可以实现单结构域荧光蛋白索烃的细胞内合成。

图2. a, 绿色荧光蛋白索烃的合成。b, 融合蛋白索烃的合成。

作者随后探究了索烃化对于蛋白质构效关系的影响。在高温加热和冷却复性之后，绿色荧光蛋白索烃的荧光可以完全恢复，远优于其环状对照和线性对照的荧光恢复情况，具有良好的热回复性。这一性质在融合蛋白索烃中也得以保持（图3a）。此外，索烃的拓扑结构也为融合蛋白索烃中的功能蛋白提供了一定的构象限制，有效提升了功能蛋白的热回复性、热稳定性以及机械稳定性（图3b）。

图3. a, 索烃化能够有效提升蛋白质的热回复性。b, 索烃化能够提供额外的构象限制，提升功能蛋白的热回复性、热稳定性以及机械稳定性。

综上所述，作者将绿色荧光蛋白的二级结构基元重新接线，结合两步合成法，实现了绿色荧光蛋白单结构域索烃的构建。这种方法不仅可以拓展到荧光蛋白家族的其他变体，实现荧光蛋白索烃家族的构建，还可以耐受其他功能蛋白的插入，作为索烃化的模板实现融合蛋白索烃的构建。这种索烃化的方法更好地实现了不同结构域之间的耦合和协同，在工业酶工程和生物医药领域具有广泛的潜在应用价值。

该研究近期在线发表于Nat. Commun.，北京大学化学与分子工程学院博士生曲志宇为该论文第一作者。北京大学化学与分子工程学院博士生王宇翔，博士后方晶、孙轶斌、刘雅杰、吴文豪也为本工作做出了贡献。北京大学化学与分子工程学院张文彬教授为通讯作者。该工作得到国家自然科学基金、国家重点研发项目、科技部、北京分子科学国家研究中心创新项目的支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-39233-7