拓扑蛋白质因其独特的结构特征和功能优势正逐渐引起研究者的关注。在天然蛋白质结构中已发现环状、纽结、套索和链环等不同的拓扑类别，它们所展现出的稳定性优势启发着研究者将拓扑作为蛋白质工程的全新维度。利用以p53缠结二聚结构域为代表的蛋白质同质缠结基元和可基因编码的蛋白质化学偶联工具，研究者已成功实现包括轮烷、套索、索烃和纽结等不同拓扑蛋白质的人工设计与合成。然而，目前可用的蛋白质缠结基元数量有限，结构多样性欠缺，大大限制了蛋白质拓扑工程的拓展和应用。

为了进一步丰富蛋白质拓扑工程的工具箱，张文彬课题组近期对蛋白质结构数据库进行了系统检索，发现了多种具有拓扑工程潜力的蛋白质异质二聚缠结基元，对缠结二聚体的结构和功能特征的分析揭示了链缠结在提高复合物稳定性以及发挥特定生物学功能方面所扮演的重要角色，利用这些缠结基元可实现不同异质[2]索烃的合成，展示了异质缠结基元在蛋白质拓扑工程中广阔的应用前景（图1）。

图1. 研究概览。

首先，对来自PDB的23741个蛋白质异质二聚体进行聚类，通过序列长度、高斯连接数（GLN）和包埋表面积（BSA）等参数进行筛选，得到155个具有显著缠结特征的异质二聚体。对这些缠结二聚体结构特征的分析揭示了链缠结形成的三种主要机理，包括：（1）单体蛋白质前体的酶切；（2）协同折叠和组装；（3）直接相互作用形成的穿环和缠绕。而对这些缠结二聚体生物学功能的分析则揭示了链缠结在提高复合物稳定性、结合DNA能力和加强酶催化等方面所扮演的重要角色。进一步通过人工校验，从这些缠结二聚体中筛选得到20个具有拓扑工程潜力的基元，并选择其中6个进行了湿实验验证，通过包括质谱、凝胶电泳、TEV蛋白酶酶切等实验证明这些缠结基元均可介导异质[2]索烃的胞内合成（图2）。

图2. 异质二聚缠结基元的实验验证。(a) 基于异质二聚缠结基元和正交的分离型内含肽实现异质[2]索烃胞内合成的示意图；(b) 通过TEV蛋白酶的酶切实验证明异质[2]索烃的拓扑结构。

除了直接合成单结构域异质索烃，这些缠结基元还可耐受与不同功能结构域的融合。将CFP和YFP分别融合到缠结基元的两个单体，设计了机械偶联荧光蛋白FRET对，由于索烃骨架的构象限制，酶切后FRET信号明显增强，证明索烃结构可被应用于调控功能基元的距离和取向（图3a）。而将两种亲和体AffiHER2和AffiEGFR分别融合到缠结基元的两个单体上，则可很好地保留亲和体的受体结合能力，得到双特异性抗体类似物，证明异质索烃结构在多功能集成方面具有出色的应用潜力（图3b）。

图3. 基于异质二聚缠结基元设计机械偶联荧光蛋白FRET对(a)和双特异性抗体类似物(b)。

综上所述，这项研究工作建立了蛋白质异质缠结基元的生物信息学分析、实验验证和工程应用的平台，为拓扑蛋白质研究提供了新的工具和方法。丰富的异质缠结基元可为蛋白质拓扑工程提供更多的设计空间，帮助开发结构和功能可调控、可集成的生物材料。

该研究以“Heterodimeric protein entangling motifs: systematic discovery, feature analysis, and topology engineering”为题，近期在线发表于Chemical Science，通讯作者为北京大学张文彬教授，第一作者为北京大学许连杰博士，北京大学博士生田锡宝也为本工作做出了贡献。该工作得到了科技部国家重点研发计划、国家自然科学基金、北京分子科学国家研究中心的资助。

原文链接 https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2025/sc/d5sc03953c